實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒作為現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域的重要工具，憑借其特殊的工作原理和優(yōu)勢(shì)，在疾病診斷、基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。核心在于其能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)DNA或RNA的擴(kuò)增過程，并將擴(kuò)增信號(hào)轉(zhuǎn)化為可量化的熒光信號(hào)。其原理主要基于以下兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)：
 

　　1.熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)：試劑盒中的熒光探針由報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)組成。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，此時(shí)儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)。在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成同步。
 

　　2.定量原理：通過監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)了解PCR擴(kuò)增的進(jìn)程。在PCR反應(yīng)的指數(shù)擴(kuò)增階段，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與起始模板的數(shù)量呈正相關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法，即使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以將未知樣品的Ct值(熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù))與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而計(jì)算出未知樣品的起始拷貝數(shù)。
 

　　實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的測(cè)定步驟：
 

　　-分區(qū)操作：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀時(shí)，擴(kuò)增區(qū)與產(chǎn)物分析區(qū)可合并。
 

　　-試劑解凍：從-20℃冰箱取出試劑盒，室溫解凍約15分鐘。振蕩混勻5秒，離心5秒使管壁液體集中。
 

　　-樣本處理：將病毒采樣管在旋渦混合儀上震蕩5秒混勻。
 

　　-核酸提取：按照試劑盒說明書進(jìn)行RNA或DNA的提取和純化。
 

　　-根據(jù)試劑盒說明書中的配方，將DNA模板、引物、探針、酶等成分按比例加入PCR管中，制成PCR反應(yīng)液。
 

　　-將配制好的PCR反應(yīng)液加入PCR管中，然后加入適量的礦物油(如果需要)以防止蒸發(fā)。
 

　　-將需要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)輸入PCR儀中，包括變性溫度、退火溫度、延伸溫度以及循環(huán)次數(shù)等。
 

　　-將PCR管放入PCR儀中，啟動(dòng)程序開始擴(kuò)增。
 

　　-擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量分析。